2-3.新しい多型解析技術の開発 Development of polymorphism detection system

We developed a DigiTag2 method as a way of simultaneously typing from tens to hundreds of SNPs that are considered necessary to identify the primary associated SNP in disease susceptibility candidate region. Digitag2 can be performed using general experiment equipment and interpretation of SNP nucleotide is straightforward.

グループリーダー: 西田 奈央

<研究背景>

ゲノムワイド連鎖解析やゲノムワイド関連分析によって検出される候補領域において第一義的な疾患感受性遺伝子多型を特定するためには、数十から数百種類のSNPを高い成功率でタイピングする技術を確立することが求められます。

<研究のアプローチ>

疾患感受性候補領域における絞り込みに必要と考えられる数十から数百種類のSNPを同時にタイピングする方法としてDigiTag2法を開発しました。DigiTag2法は各SNPの遺伝子型をオリゴDNAタグへ変換して解析を行うことにより、汎用的な実験プロトコル・装置を用いてマルチプレックスSNPタイピングを行うことができます。また、ここで使用するオリゴDNAタグは物理・化学的性質が一様となるように設計されたオリゴDNAであるので、SNPタイピングをより高い精度、再現性で実行できると考えています。

*オリゴDNAタグ

オリゴDNAタグは物理・化学的性質が一様となるように設計した23塩基長のオリゴDNAです。設計したオリゴDNAの中からランダムにいくつかを選び、融解温度の測定、融解曲線を利用したハイブリダイゼーション効率の測定、共通プライマーペアを用いたPCRによる増幅効率の測定、DNAチップによるミスハイブリダイゼーションの測定を行うことにより、設計したオリゴDNAが自己二次構造をとりにくく、相補鎖以外のオリゴDNAとのミスハイブリダイゼーションが少ない構造となっていることが確認されています。これらのオリゴDNAを用いることで、一様なPCR増幅効率、DNAチップへの一様なハイブリダイゼーションを行うことが可能になると考えられます。

<主な成果>

これまでに、複数のSNPの遺伝子型を同時にオリゴDNAタグへ変換し、汎用的な実験プロトコル・装置を用いてマルチプレックスSNPタイピングを行う方法としてDigiTag法を報告しました。また、Genotyping用プローブの構造を変えることによりプローブの合成コストを抑え、反応操作を簡便化したDigiTag2法を報告しました。
IL-4、IL-13を中心とした610kbの領域に存在する96種のSNPsを対象として936検体でDigiTag2法の実用性を検討したところ、約9割のSNPsについて同時並列タイピングが可能であり、タイピング結果はダイレクトシークエンシングの結果と100%一致することが明らかとなりました。また、従来のSNPタイピング法では遺伝子型を決定することのできなかった19種のSNPsを選択してDigiTag2法を試みたところ、16種のSNPsはタイピングが可能であることが明らかとなりました。

<本研究に関する文献>

  • Srilohasin P, Chaiprasert A, Tokunaga K, Nishida N, Prammananan T. (2014) A novel DNA chip based on modified DigiTag2 assay for high throughput species identification and genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol 52(6):1962-8.
  • Shimogiri T, Nishida N, Kudo M, Niwa K, Nishibori M, Kinoshita K, Okamoto S, Maeda Y, Tokunaga K, Yasue H (2012) Genetic relationships between Japanese native and commercial breeds using 70 chicken autosomal SNP genotypes by the DigiTag2 assay. Anim Genet 43(1):98-103.
  • Nishida N, Mawatari Y, Sageshima M, Tokunaga K (2012) Highly parallel and short-acting amplification with locus-specific primers to detect single nucleotide polymorphisms by the DigiTag2 assay. PLoS One 7(1):e29967.
  • Ishii T, Muraki K, Shimada N, Kano A, Nishida N, Tokunaga K, Maruyama A (2008) Application of partially double-stranded DNA probes to high-throughput SNPs genotyping. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf) 52:237-238
  • Fujimoto A, Ohashi J, Nishida N, Miyagawa T, Morishita Y, Tsunoda T, Kimura R, Tokunaga K (2008) A replication study confirmed the EDAR gene to be a major contributor to population differentiation regarding head hair thickness in Asia. Human Genetics 124(2):179-185
  • Nuchnoi P, Ohashi J, Naka I, Nacapunchai D, Tokunaga K, Nishida N, Patarapotikul J (2008) Linkage disequilibrium structure of the 5q31-33 region in a Thai population. Journal of Human Genetics 53(9):850-856
  • Yuliwulandari R, Sachrowardi Q, Nishida N, Takasu M, Batubara L, Susmiarsih TP, Rochani JT, Wikaningrum R, Miyashita R, Miyagawa T, Sofro AS, Tokunaga K (2008) Polymorphisms of promoter and coding regions of the arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene in the Indonesian population: proposal for a new nomenclature. Journal of Human Genetics 53(3):201-209
  • Nishida N, Tanabe T, Takasu M, Suyama A, Tokunaga K (2007) Further development of multiplex single nucleotide polymorphism typing method, the DigiTag2 assay. Analytical Biochemistry 364(1):78-85
  • Nishida N, Tanabe T, Hashido K, Hirayasu K, Takasu M, Suyama A, Tokunaga K (2005) DigiTag assay for multiplex single nucleotide polymorphism typing with high success rate. Analytical Biochemistry 346(2):281-288
  • 下桐猛、西田奈央、丹羽孝介、西堀正英、工藤美雪、平岩秀樹、岡本新、前田芳實、徳永勝士、安江博 (2008) わが国で開発されたDigiTag2法によるニワトリSNPsの同時検出. 動物遺伝育種研究 36(2):221
  • 西田奈央、田邊哲也、高須美和、陶山明、徳永勝士(2007)DigiTag2法によるマルチプレックスSNPタイピング, DNA多型 DNA POLYMORPHISM 15:256-259
  • 西田奈央、平安恒幸、高須美和、陶山明、徳永勝士 (2006) DigiTag法を用いたマルチプレックスSNPタイピング, DNA多型 DNA POLYMORPHISM 14: 18-21
  • 西田奈央、平安恒幸、高須美和、陶山明、徳永勝士 (2005) DNAコンピューティングの原理に基づく新規SNPタイピング法の開発, DNA多型 DNA POLYMORPHISM 13: 14-16

(文責:西田 奈央)

研究内容・設備

1.疾患関連研究
(Genetics and complex human diseases)

2.ヒトゲノムDNA解析システム
(Human Genome DNA analysis system)

3.データベース・解析ツール
(Database and analysis tool)

4.日本人健常者の全ゲノム多型・配列解析データの提供方針
(Data sharing policy of whole-genome polymorphism/sequence data of Japanese healthy individuals)